从1482年起，达·芬奇在米兰生活了17年。这时，他在科学研究和艺术创作上，进入了一个最成熟、也是最繁荣的时期。这幅《最后的晚餐》，就是他接受米兰圣马利亚·德烈·格拉契修道院的订件。这幅画约从1495年画起，画了3年。这是一个传统的《圣经》题材，两个世纪来，许多著名画家在这一题材上尝试过，但都存在某种不足，首先是人物缺乏心理冲突，故事的戏剧性展开不生动。而达·芬奇这幅画，克服了过去所有这一题材的表现缺点，从人物的活动、性格、情感和心理反应等特征上，加强了故事的深刻寓意，通过耶稣与犹大的冲突，反映出正义与邪恶之间的对立。实际上，它所展现的，正是当时意大利社会光明与黑暗斗争的缩影。
《最后的晚餐》取材自基督教《新约全书》“马太福音”第二十六章“设立圣餐”的一节：在逾越节的一个晚上，耶稣预知他的死期将临，和他的12个门徒在一起进晚餐。正在进餐时，耶稣对众门徒说：“我实在告诉你们，你们中间有一个人要出卖我。”门徒们听后，顿时引起闪电般的反应，他们个个感到突兀，有的转身，有的站起来向主发问：“主，是我么？”耶稣回答：“同我蘸手在盘子里的，就是他要卖我。”犹大就问他：“拉比，是我么？”耶稣回答：“你说的是。”
在这幅画上，达·芬奇是这样来构思这一题材的，他对称地设计了两边各6个门徒的形体动作：
左边一组由巴多罗米奥、安德烈、小雅各3人组成。
右边一组由马太、达太和西门组成。
中右一组是多马、老雅各、腓力。
中左一组的彼得、约翰和犹大3人最富有表情，也是画上的主要角色。对犹大，达·芬奇采取了特别的表现手法：犹大情绪紧张，身子稍向后仰，右臂支在桌上，右手握紧钱袋，露出一种抑制不住的惊恐。这13个人中，只有犹大的脸色是灰暗的。
坐在正中央的耶稣摊开双手，把头侧向一边，作无可奈何的淡漠表情，加强了两边四组人物的变化节奏感，使场面显得更富有戏剧效果。而这12个人，由于各自的年龄、性格和身份不同，他们的惊讶与疑虑表情也得到各自贴切的表现。人物之间互相呼应，彼此联系，感情不是孤立的，这是大画家达·芬奇最重要的、也是最成功的心理描写因素。古代所谓“多样统一”的美学原则，在达·芬奇的这幅画上得到了空前有效的体现。
在空间与背景处理上，达·芬奇利用食堂壁面的有限空间，用透视法画出画面的深远感，好像晚餐的场面就发生在这间食堂里。他正确地计算离地透视的距离，使水平线恰好与画中的人物与桌子构成一致，给观众造成心理的错觉，仿佛人们亲眼看见了这一幕圣经故事的场面。在这幅画的背景上有成排的间壁、窗子、天顶和背后墙上的各种装饰。它那向心力的构图是为取得平衡的庄严感的对称形式，运用得不好，很容易形成呆板感。明暗是利用左上壁的窗子投射进来的光线来表现的。所有人物都被画在阳光中，显得十分清晰，唯独犹大的脸和一部分身体处在黑暗的阴影里。这种象征性的暗示手法，在绘画上是由达·芬奇开始的。
达·芬奇为这幅画所搜集的资料之多是惊人的。3年间，他苦苦追索着各个人物的模型。教堂的主持人嫌他画得太慢，向教皇告状。一次，达·芬奇不得不对教皇说：犹大这个形象实在难找，不然，就把教堂主持者的头像用上去算了。吓得主持者再也不敢去催促他。他作了许多人物速写，最后，他在下层的无赖人物中找到了一个可以充作犹大的头像。我们从他的许多草稿中，可以测知他在全局构思时的思想发展过程。他在确立每一个人物的年龄、身份、性格及其经历等特征时，总是一边画，一边记录一些文字：“一个人饮过酒，把杯子放下，头即转向说话者；另一个人合拢双手，紧蹙双眉，看着自己的同伙；另一个人伸出两手的手掌，把肩耸到了耳边，嘴上又显出惊奇的状态……”这些形象资料，只有深入地对生活进行观察，才能积累起来，而艺术家的创新和意图的实现，也必须依靠这些可贵的生活资料。
达·芬奇如此费尽心机地创作，不仅仅是为了画好一节圣经故事，而是要通过犹大的叛变与正义人们的精神反应来隐喻人间的善恶斗争。作为一位伟大的人文主义艺术家，达·芬奇的民主主义立场在意大利资产阶级上升时期是坚定的。事实也证明，他的这幅《最后的晚餐》，长期来一直受到世界正义人民的赞赏。