嘉靖四十三年（1564年），海瑞告别了他改革兴利的江西兴国县（任知县计有一年半），被朝廷调入京城任户部主事。
户部主事在明朝户部衙门里只是六品官阶，但主管的却是银两财务。他很快发现，近半年来银两耗费过大，损失浪费的银两至少占钱粮总收入的十分之三，这使他忧心忡忡。
他发现，户部衙门里的人际关系非常紧张，官员之间谨小慎微，每当涉及朝廷政务，个个缄默不语。有一天，海瑞与户部间务（官居九品）何以尚交谈朝中最近出现的事情。因为何以尚是海瑞的下属，又是钦佩海瑞人品的知心朋友，因此两人过从甚密。海瑞从交谈中得知，兵部员外郎杨继盛上疏（封建时代臣下向皇帝陈述事情的报告叫“疏”）嘉靖皇帝，揭发检举大奸臣严嵩的罪行而被嘉靖皇帝降旨斩首。杨继盛在临刑前留有一首诀别诗：
浩气还太虚，丹心照万古。
生前未了事，留于后人补。
海瑞对杨继盛因直言上谏而遭杀害之事既愤愤不平，又颇有感慨，尤其是“留于后人补”一句诗，深深地打动了海瑞的心。
嘉靖年间，许多地方大兴土木，修建庙宇寺院。此风源自当朝皇帝，嘉靖皇帝崇尚迷信，不理朝政，住在西苑，整天拜神作斋醮，上青词。宰相严嵩、徐阶都写过青词，以讨皇帝的欢心，并使自己获得皇帝的宠信。皇帝痴迷求神求仙，势必修庙建坛，耗费的银两令人吃惊。有些官员除了忙于大规模修建庙坛之外，还忙于采摘灵芝仙草，进贡白鹿或白兔。更有甚者，皇帝派大臣去崂山、武当山等地去寻找神仙，把一批道士请进皇宫。宫中的房屋梁柱上，贴满了各式各样的符咒。在精雕细刻的御花园里，竟然搭建起炼丹炉，火焰、烟灰、黑浪弥漫花园上空，使人神魂迷乱。从崂山请来的道士王道陵，像变魔术似的从自身道袍袖管里掏出一只桃子，敬献给皇帝说：“这是天赐蟠桃，以为祝寿，莫大祥瑞，万岁爷吃下会长生不老。”
太监黄锦，亲眼目睹嘉靖皇帝日渐昏庸，心中焦急，但又不敢谏言，只好把肺腑之言向海瑞诉说。
众所周知，在封建专制时代，皇帝有至高无尚的权力，皇权是神圣不可侵犯的，连皇帝的名字都要避讳，一个字不幸成为“御讳”就得缺笔而成为残缺不全的字。比如宋太祖赵匡胤的胤字，为了避讳，只得少写一笔。至于上疏批评皇帝，那绝对等于犯上作乱，冒犯龙颜，是极其少见的事。
嘉靖四十五年（1566年）的二月，海瑞冒天下之大不韪，向皇帝奏上《治安疏》，亦即著名的《直言天下第一事疏》，达3600多字，主要内容如下：
臣闻君者，天下臣民万物之主也，其任至重。欲称其任，亦惟以责寄臣工，使尽言而已。臣请披沥肝胆，为陛下陈之。
昔汉文帝，贤主也，贾谊犹痛哭流涕而言。非苛责也，而文章性仁而近柔，虽有及民之美，将不免于怠废，此谊所大虑也。陛下天姿英断，过汉文远甚。然文帝能充其仁恕之性，节用爱人，使天下贯朽粟陈，几至刑措。陛下则锐精未久，忘念牵之而去，反刚明之质而误用之。至谓遐举可得，一意修真，竭民脂膏，滥兴土木。二十余年不视朝，法幻弛矣。数年推广事例，名器滥矣。二王不相见，人以为薄于父子。以猜疑诽谤辱臣下，人以为薄于君臣。乐西苑而不返，人以为薄于夫妇。吏贪官横，民不聊生，水旱无时，盗贼滋炽。陛下试思今日天下，为何如乎？
头段文字是海瑞向皇帝表明倾吐心里话的思想动机。国君为天下臣民万物之主，责任非常重大；督责大家畅所欲言，也是国君的职责之一；我——海瑞，请求披肝沥胆，吐露真言了。
第二段文字是以汉文帝为典范，相比之下，则嘉靖皇帝远不如汉文帝。西汉文帝执行减轻租役的政策，免收全国赋税十二年，促进社会生产发展，国家开始走向富强。可是，嘉靖皇帝你呀，二十多年不理朝政，大兴土木，修道求仙，滥派官职给人；跟两个儿子不见面，猜疑杀害大臣，尽在西苑不回宫；吏贪将弱，农民暴动，天下危机四伏，你与汉文帝相比差远了。
海瑞上疏的第三段落大意是：最近罢黜严嵩相职，其子世蕃被处极刑，一时人心稍觉快活。然而，当今政治并不清明，大臣不敢直言陛下已经很久了。古代人君有过失，都要依靠群臣百官匡救辅弼。今天陛下只是会集僧道修斋，焚香行礼，词臣礼官只会一味上书颂扬。陛下的错误行为和诸臣的错误顺从，怎么能保证政治清明呢？一味奉承谄媚皇上太过分了。不过，当您的面极尽恭维，背后却有议论，难道这不是欺君之罪吗？
海瑞上疏的第四段文字是这样的：
夫天下者，陛下之家。人未有不顾其家者，由外臣工皆所以奠陛下之家而盘石之者也。一意修真，是陛下之心惑；过于苛断，是陛下之情偏。而谓陛下不顾其家，人情乎？……《记》曰：“上人疑则百姓惑，下难知则君长劳。”此之谓也。
《记》指的《礼记》，“上人”指嘉靖皇帝——您猜疑人，百姓必然迷惑、惶恐。
海瑞上疏的第五段文字是对皇帝的尖锐批评：“您犯的错误很多，天下的人不满意您已经很久了，内外大小官员谁都知道您自以为是，拒绝批评，您的错误很严重。您一心想成仙得道，长生不老。对比唐尧、虞舜、夏禹、成汤、周文王、周武王这些上古时代的贤君名主，圣功昌盛，并没有长命百岁，生存世间；世代依次更替到后代，也没见到世俗之外的人自汉代、唐代、宋代直到今天生存下来。您的老师陶仲文，教给您方术，如何寻求长生不死，可是他几年前已经死掉了，他都不能长生不死，您怎么还幻想长生永存呢？至于上天恩赐于您的仙桃、药丸，那就更奇怪了，仙桃、药丸究竟是怎么来的呢？是上天亲自用手拿给您的吗？过去宋真宗在乾佰山获得天书，当时孙奭规劝说：“上天如何会讲人话呢？哪里有什么天书。”您应该知道，桃子是从桃树上采摘下来的，药丸是经过各种加工配制而成的，今天无缘无故获得了桃和药，难道是这两物有脚有腿地走到面前的吗？ 这是陛下左右那些邪恶不忠的人，特别是崂山道士制造荒诞的言论欺骗蒙蔽您啊！而您误信了，这是您犯下的过错。
海瑞上疏的第五段文字重在陈述皇帝在用人问题上所犯的错误。他写道：“陛下又将谓悬刑赏以督责臣下，则分理有人，天下无不可治，而修真为无害已乎？太申曰‘有言逆于汝心，必求诸道；有言逊于汝志，必求诸非道。’用人而必欲其唯言莫违，此陛下之计左也。”
显然，海瑞引用商代主君王太甲的话：有人说话不顺从您的心意的时候，您必须探索道理；有人说话恭敬顺从您的志向，您必须探索非议的理由。而您的用人原则就是要求他完全服从，这是您用人计谋不当之处。严嵩他有一点不顺从您的心意吗？过去他曾对您附首听命，今天他却成为扰乱朝纲的罪魁祸首。再说梁材，他曾是镇守浙江、广州等地的官员，您认定他是不顺从您的逆者，可是他治理地方有功，声望很高，官至户部尚书，仍为诸多官民赞扬。问题是，许多官员宁愿做严嵩式的顺从您心意的人，而不愿做梁材式的违逆您心意的人，难道不是看您的脸色行事，想方设法迎合您的心愿吗？这样下去，对您一点好处也没有。
海瑞上疏的最后部分是向皇帝提出几点建议：一是要立即醒悟过来，每天上朝，与诸臣商讨国计民生；二是改掉以前的错误，为人民百姓谋福祉；三是着重处理目前存在的君道不正，臣职不明的问题，这是摆在您面前的头等大事。
提出上述要求之后，海瑞表明自己的一片忠心：
释此不为，而切切于轻举度世，敝精劳神，以求之于系风捕影，茫然不可知之域，臣见劳苦终身，而终于无所成也。今大臣持禄而好谀，小臣畏罪而结舌，臣不胜愤恨，是以冒死，愿尽区区，惟陛下垂听焉。
海瑞写就《治安疏》前前后后花费了一个月的时间，在充分搜集资料的同时，还拜访了几位有正义感的朝廷大臣，几易其稿，最终形成了历史上的经典传世之作。据有关史书记载，《治安疏》成就之时，海瑞反复阅读，读到最后部分手总是颤抖，因为他知道，一旦奏章呈递上去，一定会招来杀身之祸。自己的性命倒无所谓，可是养育自
己的母亲谢氏、妻子王氏、还有儿子都会受到株连。“人生自古谁无死，留取丹心照汗青”。海瑞下定决心后，便给母亲留下一封信（实际上是诀别遗言），恳请老人家原谅儿子忠孝不能两全，儿子我自小到大饱受您精忠报国的教诲，今天，真正到了兑现诺言的时刻。假如我因为上疏而死，那只有麻烦您老人家带儿媳、孙子回老家隐居。海瑞是位善待他人的清官，他早把仆人、差役遣散故里。海瑞盘查自己的行囊，有银子二十余两，便到临街棺材铺，请木匠师傅量好尺寸，尽快打造一口棺木，以备后事。
《治安疏》是在一次早朝上由海瑞自己呈献给嘉靖皇帝的，由于奏折洋洋洒洒三千六百余字，皇帝当时没来得及看，便命宰相徐阶拿到寝宫后再看奏章。
嘉靖皇帝是17岁时正式登上皇帝宝座，经历41个春秋，这一年（1566年）已58岁了，再加上平时服用崂山道士从炼丹炉里烧制的药丸，他的眼睛昏花了，看不清楚文字，只了由徐阶代读。
嘉靖皇帝听那奏章中的言语，从一开始就不顺耳，之后越听越怒火中烧，尤其听到最刺耳的一段话：“陛下花了许多钱，用在宗教迷信上，而且一天比一天多，弄得老百姓的生活困苦不堪，这十几年来更是越来越过分。天下百姓就取陛下改元的年号的字音，说嘉靖皆净，家家穷得干干净净，没有钱用。”他恼羞成怒地喊道：“大逆不道，简直是可恨至极，这不是反了吗？先帝爷也没有这样骂过朕啊！”
“快！赶快捉拿海瑞，决不能让他逃跑！”嘉靖皇帝对左右的侍臣说。
太监黄锦在一旁说：“万岁爷息怒。奴才闻听这个人素来狂乱妄为，此次上疏的时候，自己知道冒犯皇上必当死罪，事先诀别了母亲和妻子，也买下棺材，家中的僮仆也都离散，只等待朝廷问罪，看来他是不会逃跑的。”
皇上沉默不语，过了片刻又让徐阶阅读海瑞的奏章，长叹了几声，并把奏章留在龙案之上，沉思起来。
“我数十年寻求长生不死，而这个海瑞却不怕死，还买好了棺材等死，真是匪夷所思！”过了好久，皇上在宫女的搀扶下喝了一碗参汤后又自言自语道：“朕为天子，竟然挨了他的骂，大失颜面，这口气非出不可。”第二天，他降旨捉拿海瑞，并派锦衣卫逮捕海瑞。
在海瑞被捕入狱的第四天，海瑞的莫逆之交，也是他的属下何以尚闯进皇宫外，猛敲臣子请求皇帝上朝的景阳钟，呈上替海瑞鸣冤叫屈的奏章，诚请释放忠臣海瑞。嘉靖皇帝当即命令锦衣卫将何以尚重打四十板（另一说杖打一百），遂后关进监狱，同海瑞一起坐牢。
海瑞另一位好友王宏海，受海瑞委托，把海瑞预先写好的诀别信秘密地传送到海南的琼山，海瑞的母亲和妻子王氏因北方寒冷，早在《治安疏》上呈之前已离开了京城，回到故乡居住。
余怒未消的嘉靖皇帝要把海瑞处斩，责令刑部草拟处死海瑞的奏章，奏章辗转到宰相徐阶手中，被徐阶有意搁置起来，没有及时呈上御批。
或许是苍天有眼，也可能是海瑞命大，恰在徐阶搁置刑部拟斩海瑞奏章的当口，皇帝病倒了，因为吃丹药，毒性发作，卧床不起直至驾崩。
据有关明史资料记述，嘉靖皇帝驾崩前说过这样的话：“海瑞这个人可与殷纣王时的比干相比拟，但朕不是殷纣王罢了。”恰逢皇上病入膏盲之际，急召宰相徐阶等近臣商议帝王内禅问题，皇上还说过自相矛盾的话：“海瑞奏章所言之书，现在想起来是正确的。如今朕病成这样，哪里能临朝议事听政……唉！朕没能谨慎珍惜，才招致如此疾病，倘使朕能从西苑别宫便殿出去，返回大内，难道不等于接受海瑞的辱骂了吗？”
嘉靖驾崩，太子朱载垕继位，改元隆庆。徐阶、张居正等元老、大臣，借用嘉靖皇帝遗诏的名义，斩首了骗君、祸国、殃民的道士王道陵等多人。新皇继位，登基大典之际常有大赦，海瑞、何以尚被释放出狱，官复原职。
海瑞从治安上疏到买棺谏君，再从身陷诏狱到释放复官，九死一生，历经坎坷，彰显了他刚直不阿的本色。海瑞骂皇帝，这在中国古代社会里是少见的，也是他一生中闪光的一笔，这一笔，既闪现了他的慷慨人生，更激励了他在明朝中后期的仕宦生涯中，不畏权贵、不畏艰险的斗志。