10月19日，国民政府军事委员会正副参谋总长何应钦、白崇禧发出给八路军朱德总司令、彭德怀副总司令和新四军叶挺军长的“皓电”，攻击中国共产党及其领导的武装力量，将国民党的“中央提示案”以最后决定形式通知共产党，要求在大江南北坚持抗日的新四军于一个月内全部开赴黄河以北，并要求将50万八路军、新四军合并缩编为10万人。与此同时，国民党又密令汤恩伯、李品仙、韩德勤、顾祝同等部准备向新四军进攻。
“皓电”表明了国民党的反共决心和咄咄逼人之势。这就要求中国共产党作出明断，制定正确的对策，任何优柔寡断，都将带来严重的后果。11月3日，毛泽东致电叶挺、项英，告以中央决定用朱德、彭德怀、叶挺、项英名义，答复何应钦、白崇禧皓电。并指示，对国民党取缓和态度，以期延缓反共战争爆发时间，皖南方面决定让步北移。同日，毛泽东又致电李克农、项英，指出反对直接投降是目前全国的中心任务，迅速动员起各方面舆论，制止投降与内战；加紧统战工作，尤要向粤桂军队说明反共和投降是一回事，告诉他们不要上蒋介石的当；速告各方准备对付全国规模的黑暗局面，全党应该完全地有秩序地退却下来。
1941年1月4日，新四军九千余人从云岭驻地出发绕道北上。6日，经泾县茂林地区突然遭到数倍于我的国民党军队的包围袭击。新四军将士虽奋力拼杀，终因寡不敌众，除部分部队突围外，大部被俘、失散或牺牲。军长叶挺被国民党军队扣留，项英也不幸遇难。这就是震惊中外的皖南事变。它的发生，标志国民党顽固派发动的第二次反共高潮达到最高峰。
皖南事变的消息传到延安后，毛泽东既为蒋介石敢冒天下之大不韪而愤怒，又为新四军将士身陷重围而担忧。在新四军突围的几天里，毛泽东一直关注着前方的事态发展，命令有关方面加强同皖南方面联系，一有新情况就立即报告。他指示在重庆的周恩来、叶剑英，向国民党提出严重交涉。
1月11日，《新华日报》社举行创刊三周年庆祝活动，周恩来到会讲话。正当他讲话的时候，南方局机要员送来中共中央的急电。周恩来一看完，立刻用沉痛的语调宣布新四军局势的严重。这时，饭厅里的电灯突然熄灭，四周一片漆黑，过了一会儿才亮起来。周恩来意味深长地激励大家：“黑暗是暂时的，光明一定会到来。”他接着说，“有革命斗争经验的人，都懂得怎样在光明和黑暗中奋斗。不但遇着光明不骄傲，主要是遇见黑暗不灰心丧气。只要大家坚持信念，不顾艰难，向前奋斗，并且在黑暗中特（显）示英勇卓绝的战斗精神，胜利是要到来的，黑暗是必然被冲破的。”
当晚，他召开南方局紧急会议，研究事变发生后的局势和斗争的方针。组织力量，广泛地向国民党内主张团结抗战的人，以及社会各方面揭露国民党顽固派的反共罪行。周恩来还写信给蒋介石，要蒋介石命令国民党部队立即撤围，给北上的新四军让路。他在信中说：否则新四军渡江无路，后退无援，只有突围四出，散于民间，战于敌后，以求生存。
1月17日晚，国民党中央通讯社发布了国民党的军事委员会的通令和发言人谈话，反诬新四军“叛变”，悍然宣布撤销新四军番号，声称要把叶挺交付军法审判。这就把国民党的第二次反共高潮推到了顶点。
周恩来得知后，立刻义愤填膺地打电话给何应钦，痛斥他：“你们的行为，使亲者痛，仇者快。你们做了日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人。”随后驱车到国民党谈判代表张冲处，当面提出质问和抗议。
当晚，南方局在红岩八路军办事处召开会议，仔细估计国民党命令公布后的局势，研究如何向国民党统治区人民和全世界揭露国民党顽固派这一破坏团结抗战、破坏国共合作的阴谋，决定在《新华日报》上刊登周恩来为皖南事变所写的题词。
那时国民党有着严格的新闻检查制度。报纸稿件都需事先经过审查，有关皖南事变的记载全部被扣。就这样还不放心，那天晚上10点多钟，新闻检查所派人来到《新华日报》社，坐等审查第二天《新华日报》的大样。报社准备了两种不同版面：一种是给新闻检查所派来的人看的，上面没有周恩来的题词；另一种刊登有周恩来的题词手迹。周恩来在红岩办事处把题词写好后，派副官立刻送往报社，并且指示：要报社加快编排和制版力量，组织好发行力量，务必抢在第二天各大报发行以前，将报纸送到广大读者手中。题词共两条。在第二版占六栏地位的是：“为江南死国难者志哀。”在第三版占五栏地位的是一首诗：“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急。”
这满含悲愤的25个字，产生了震撼人心的强大力量，一下揭穿了皖南事变的实质，表达了对国民党顽固派最强烈的抗议。报社将题词刻成木版后，立即拼版，加速印刷。黎明前就把印好的报纸包在铺盖卷里，装在箩筐里，从红岩后山偷运进城，送到读者手中。当国民党顽固派发现市面上出现印有周恩来题词手迹的报纸时，大批报纸早已冲破山城的浓雾传遍了全城，轰动了整个重庆。这天的报纸，上午就在市内销完，在社会上产生巨大的反响。2月2日，毛泽东从延安致电周恩来说：“收到来示，欣慰之至，报纸题字亦看到，为之神王。”
皖南事变在全国引起强烈的震动。毛泽东觉得必须利用这次机会把国民党顽固派，把蒋介石的真面目暴露在光天化日之下。1月20日，中共中央军委发布由毛泽东起草的命令，宣布重建新四军军部，任命陈毅为代理军长，张云逸为副军长，刘少奇为政治委员，赖传珠为参谋长，邓子恢为政治部主任。同日，毛泽东以中共中央军委发言人名义向新华社记者发表谈话，向全世界和全国人民揭露了国民党蒋介石进行反共投降活动的全部阴谋，并提出了共产党关于解决皖南事变的办法，要求国民党：第一，悬崖勒马，停止挑衅；第二，取消1月17日的反动命令，并宣布自己是完全错了；第三，惩办皖南事变的祸首何应钦、顾祝同、上官云相三人；第四，恢复叶挺自由，继续充当新四军军长；第五，交还皖南新四军全部人枪；第六，抚恤皖南新四军全部伤亡将士；第七，撤退华中的“剿共”军；第八，平毁西北的封锁线；第九，释放全国一切被捕的爱国政治犯；第十，废止一党专政，实行民主政治；第十一，实行三民主义，服从《总理遗嘱》；第十二，逮捕各亲日派首领，交付国法审判。
毛泽东为中国共产党制定的解决皖南事变的办法及12条要求，针锋相对，刚柔并举，使蒋介石陷入了进退维谷的境地。进，则遭到人民的更强烈的反时；退，则自己承认错误，在全国人民面前大失面子。毛泽东充分利用蒋介石的困境，使中国共产党处在有理有利的地位。同时，毛泽东表示了非常强硬的态度，不惜与国民党的合作破裂。1月20日，他致电周恩来等，指出：“蒋介石已将我们推到和他完全对立的地位，一切已无话可说。”1月25日，他又在给周恩来的指示中指出：“人家已经宣布我们叛变，我们决不能再取游移态度，我们决不能再容忍，我们决不能怕破裂。”1月27日，他指示周恩来，要抓住皖南事变及1月17日命令不放，除非蒋介石取消1月17日命令，并实行中国共产党提出的“十二条”，否则，就不同蒋介石谈判。
毛泽东提出的解决办法，合情合理，引起重大反响，不仅“全党一致拥护，情绪异常兴奋”，而且深受党外人士的好评。国民党爱国民主人士宋庆龄、何香凝、柳亚子、彭泽民、陈友仁等联名致信蒋介石，谴责政府当局对新四军的迫害，要求释放叶挺；从前怕共产党过于强硬会引起破裂的民族资产阶级代表陈嘉庚、张一麐等仗义执言；冯玉祥、于右任、孙科等也对蒋介石表示不满，冯玉祥说：“只有共产党的十二条，国事才能解决。”这件事，在国际上也引起广泛重视。斯特朗、斯诺等在美国报纸上发表报道和评论，向世界披露皖南事变的真相。英、美、苏等国都不支持蒋介石的做法，对他形成很大压力。
蒋介石突然陷入了内外交困、空前孤立的狼狈境地，这使他始料不及，更加出乎他意料的是，连日本军队也没有因为他发动反共内战而停止进攻。1月下旬，日军发动豫南战役，将国民党军15万人包围在平汉铁路以东，两军发生激战。毛泽东评论说：这对蒋介石“是一瓢极大的冷水，把他的全部的幻想打破了”。毛泽东判断：“他们非求得个妥协办法不可，敌人攻得如此之急，一一七命令如此丧失人心，他的计划全部破产，参政会又快要开了，非想个妥协办法，更加于他不利。”
果然不出毛泽东所料，在中国共产党的强大政治攻势下，蒋介石几次派张冲、张治中找周恩来商量妥协办法，并且批准叶剑英回到延安。
这时，国内政治斗争的焦点已转到中共方面的参政员是否出席第二届国民参政会的问题上。第二届国民参政会参政员的名单是在皖南事变前夕公布的。中共方面的参政员仍是毛泽东、董必武、邓颖超等七人。由于皖南事变的发生，各民主党派希望通过这个会议来缓解一下国共矛盾，纷纷表示这次大会中共方面的代表必不可少。美国总统罗斯福的代表居里也表示：留在重庆，专等观光国民参政会。这给蒋介石造成很大压力，为了摆脱困境，必须争取中共方面的参政员出席会议。
中共代表是否出席这次参政会呢？毛泽东同周恩来电报往来，反复协商，认为不能无条件出席。毛泽东指出：蒋介石“从来没有如现在这样受内外责难之甚”。“目前形势是有了变化的，1月17日以前，他是进攻的，我是防御的，17日以后反过来了，他已处于防御地位，我之最大胜利在此。”“目前是迫蒋对我让步时期。非我对蒋让步时期，熬过目前一关，就好办了。”蒋介石既要中共参政员出席会议，又不肯答应中国共产党提出的十二条。为了打破僵局，经毛泽东修改审定，又提出中共中央的临时解决办法“新十二条”。它的主要内容是：要求国民党方面立即停止在全国的反共军事进攻；释放叶挺和皖南所有被捕干部，交还所有人、枪；成立各党派联合会；承认边区的合法地位，承认敌后抗日政权等。这个“新十二条”，在国民参政会开幕第二天的3月2日清晨用公函形式送去。但蒋介石仍不肯接受。同一天，毛泽东致电周恩来，根据中央书记处会议讨论意见，指出：“蒋介石正发动一切压力迫我屈服，我若出席则过去有理有利的政治攻势完全崩溃，立场全失，对我一切条件他可完全置之不理，一切文章不能做了。因此，决不能无条件出席。”毛泽东分析：中共参政员不出席会议，蒋介石也无可奈何。因为：第一，皖南事变蒋错了，举国皆知，中共以不出席抗议并没有错；第二，中共已提出让步条件（临时办法），蒋不答应，其曲在彼；第三，若蒋由此发动更大破裂行动，其曲更在彼，更于彼不利；第四，国际形势对蒋不利；第五、国内形势，彼方对我绝无办法，我毫无所惧。“只要熬过目前一关，就有好转可能，在半年内如能解决善后条件，我仍准备出席9月间的二次参政会。”
经过这场斗争，蒋介石在参政会的讲话中虽然继续攻击中共，但不得不宣称：“以后亦决无‘剿共’的军事，这是本人可负责声明向向贵会保证的”。毛泽东评论蒋介石的这个讲话是“一种阿Q主义，骂我一顿，他有面子，却借此收兵”。它实际上标志着蒋介石发动的这次规模更大的反共高潮又被击退了。这以后，国共关系又逐渐走向一定程度的缓和。
3月18日，毛泽东为中共中央起草的党内指示中指出：“这次斗争表现了国民党地位的降低和共产党地位的提高，形成了国共力量对比发生某种变化的关键。”“我党在这次反共高潮开始时采取顾全大局委曲求全的退让政策（去年11月9日的电报），取得了广大人民的同情，在皖南事变后转入猛烈的反攻（两个十二条，拒绝出席参政会和全国的抗议运动），也为全国人民所赞助。我们这种有理、有利、有节的政策，对于打退这次反共高潮，是完全必要的，且已收到成效。”为了总结打退这次斗争的丰富经验，以便更深刻地了解中国的实际国情，更自觉地在中国的复杂环境中进行有效的斗争，5月8日，毛泽东为中共中央起草了一份党内指示。这份党内指示的题目是《关于打退第二次反共高潮的总结》。其中写道：
“在中国两大矛盾中间，中日民族间的矛盾依然是基本的，国内阶级问的矛盾依然处在从属的地位。一个民族敌人深入国土这一事实，起着决定一切的作用。只要中日矛盾继续尖锐地存在，即使大地主大资产阶级全部地叛变投降，也决不能造成1927年的形势，重演四一二事变和马日事变。上次反共高潮曾被一部分同志估计为马日事变，这次反共高潮又被估计为四一二事变和马日事变，但是客观事实却证明了这种估计是不正确的。这些同志的错误，在于忘记了民族矛盾是基本矛盾这一点。
“在这种情况之下，指导着国民党政府全部政策的英美派大地主大资产阶级，依然是两面性的阶级，它一面和日本对立，一面又和共产党及其所代表的广大人民对立。而它的抗日和反共，又各有其两面性。在抗日方面，既和日本对立，又不积极地作战，不积极地反汪反汉奸，有时还向日本的和平使者勾勾搭搭。在反共方面，既要反共，甚至反到皖南事变和1月17日的命令那种地步，又不愿意最后破裂，依然是一打一拉的政策。这些事实，也在这次反共高潮中再度地证明了。极端地复杂的中国政治，要求我们的同志深刻地给以注意。”“以打对打，以拉对拉，这就是革命的两面政策。只要大地主大资产阶级一天没有完全叛变，我们的这个政策总是不会改变的。
“我们在皖南事变前所取‘佳电’的立场，对于事变后我们转入政治的反攻是完全必要的，非此即不能争取中间派。因为如果不经过反复多次的经验，中间派对于我党为什么必须向国民党顽固派进行坚决的斗争，为什么只能以斗争求团结，放弃斗争则没有任何的团结，就不能了解。
“须知中国社会是一个两头小中间大的社会，共产党如果不能争取中间阶级的群众，并按其情况使之各得其所，是不能解决中国问题的。
“向着最坏的一种可能性作准备是完全必要的，但这不是抛弃好的可能性，而正是为着争取好的可能性并使之变为现实性的一个条件。这次我们充分地准备着对付国民党的破裂，就使国民党不敢轻于破裂了。”
这一次反共高潮，从1940年10月19日何应钦、白崇禧的“皓电”为开端，到1941年1月的皖南事变和蒋介石1月17日命令达到最高峰，而3月6日蒋介石的反共演说和参政会的反共决议则是它的退兵时的一战。