《最后的晚餐》是达·芬奇毕生创作中最负盛名的壁画，现藏米兰圣玛利亚德尔格契修道院。
《最后的晚餐》作于米兰一个修道院的餐厅墙壁上。本来，在教会餐厅画《最后的晚餐》是基督教由来已久的传统，文艺复兴时期同名之画亦不少见，但达·芬奇此画却被公认为空前绝后之作，此后数百年间虽然还有许多艺术家画了《最后的晚餐》，却没有人能超过他。
“最后的晚餐”的题材，是说基督在被捕之前和12位门徒共进最后一次晚餐。席间基督把酒和面包分赐各徒，这是基督教圣餐礼的来源。但是达·芬奇在此画中却不一般地表现众人就餐的情景，他抓住当时基督说的一句话“你们中有一人出卖了我！”而引起的极富戏剧性的场面。这句话有如晴天霹雳，举座大惊，众门徒（其中就有叛徒犹大）像触电般各依其性格作出各种反应。为了把这稍纵即逝的情景固定为永恒的、既丰富热烈又统一和谐的图画，达·芬奇一反传统的排排坐般的呆板构图。他设计的是基督坐在中央，12门徒（包括犹大在内）三人一组分成4组排列餐桌两边。过去，总要把犹大单独排在餐桌之外或对面，表明他是叛徒而非圣贤，达·芬奇也破此俗套而把他置于众人之中，只是以其颓然后仰、神色慌乱暴露了叛徒的嘴脸。因此全画只有中央的基督是平静、坦然的，其余人物除犹大外莫不依其性格而表露惊恐、愤怒、怀疑、剖白、探究等神态。他们以独特的手势、一致倾注于基督的眼神和激动前倾挤向基督的身姿，表示了对老师的忠诚与关怀，与犹大（基督右手边第二人）的阴暗卑劣形成鲜明对比。他们3人一组又各自构成三角形的稳定形式，每组有一挑出的手势互相连接而直通于中央的基督，所以全画浑然一体，显示出构图的多样变化与对立统一。
达·芬奇把这幅《最后的晚餐》的壁画设计成基督和众门徒在一个餐厅里围桌而坐。此画位于教堂餐厅的一端的整块墙面上，于是画中厅堂的透视构图与实际的餐厅结构相连接，令观众觉得画中情景就发生在他们站立其中的餐厅尽头，真实感非常强烈。画家为了表现需要也可灵活运用透视规律。例如，全画取仰视角度，因画幅高出观众头上许多，可是为了餐桌食物便于观看，桌面却取俯视角度。为突出画幅中的人物形象，那张横列的餐桌有意缩小，使人物体形加大并显得紧凑，若他们都按座位入坐则会感到拥挤不堪。此外，人物神态的对比与细部食物的描绘亦多有这种精于掌握规律却又不机械屈从的情况，使画幅于逼真之中又富于气韵。
尽管《最后的晚餐》是达·芬的名作，但它的保存极不理想，由于爱好科学试验、喜用新法，在这幅灰面湿壁画上也掺用了一些油彩。但这个尝试并不成功，此画在16世纪时便已褪色霉蚀，加以修道院不加保护，餐厅长期烟熏火燎，水汽浸湿，还在画下部开一门洞，拿破仑战争时又被用作马厩，所以到19世纪时壁画已面目全非。后人曾作过多次修补。最近一次历时18年之久的精心修复于1999年4月27日正式完工，意大利当局请专家用现代科技彻底清除了大红、深蓝这些后人修补时加上去的色彩及覆盖层。虽然色彩不再像过去那么鲜艳光彩，壁画却恢复了原作的层次感和生动逼真的人物表情。
《最后的晚餐》以奇巧的构思，卓越的布局，细部写实和严格的体面关系而引人入胜。他构思此图时，将画面展现于饭厅一端的整块墙面，厅堂的透视构图与饭厅建筑结构相联结，使观者有身临其境之感。画面人物的惊恐、愤怒、怀疑、剖白等不同神态，以及姿态、神情和行为，都刻画得精细入微，惟妙惟肖。这些典型性格的描绘与画题主旨密切配合，与构图的多样统一效果互为补充，使此画无可争议地成为世界美术宝库中最完美的典范杰作。