但是格瓦拉并没有回到他熟悉的古巴。在卡斯特罗公布的格瓦拉道告信里，他宣称将断绝一切与古巴的联系，投身于世界其他角落的革命运动。为此格瓦拉深觉在道义上自己不应回古巴。
接下来的6个月里，格瓦拉极其低调地游走于坦桑尼亚首都达累斯萨拉姆、捷克首都布拉格以及东德。他除了记载自己在刚果的经过外，还开始起草两本书，准备对经济学及哲学加以论述。
卡斯特罗在获悉格瓦拉下落后，极力要求他的老同志回古巴去。后者明确声明，除非为了在拉美国家进行革命活动，因地利之便，他会在绝对机密的情况下回古巴进行筹备工作外，将不再踏上这片土地。
1966年至1967年间，格瓦拉开始在玻利维亚带领游击队员进行革命活动，化名拉蒙。当地共产主义者购买了一片密林移交给他用作训练区域。格瓦拉及其古巴同志亦编改了一些游击队员军队方式。格瓦拉的第50号游击队员有著精良装备及早期在险峻山区与玻正规兵作战的经验。然而在9月，军队却设法想消灭第二个游击队小组，杀害其中一个领导。
玻利维亚总统得知格瓦拉的存在后，扬言要杀死他。他下令军队四处搜寻他们。希望挑起革命的格瓦拉对玻形势的错误判断令他后来惨败，因为他没有在意玻身后的美国。
发现了格瓦拉的革命活动地点后，美国政府很快派出CIA人员进入玻利维亚援助反革命，政府军的装备和战斗力大为加强。而格瓦拉却得不到地方分离分子及玻共产党的预期协助。用于与古巴联络的两台短波发射机又已损坏，令他无法寄发消息到哈瓦那。游击队员用于为从哈瓦那发出的短波解码的录音机亦在渡河中丢失。这使格瓦拉完全被隔离，他的形势显得十分不妙。
CIA还帮助反对卡斯特罗政权的古巴流放分子设立审讯室，拷打那些被认为协助格瓦拉的玻利维亚人。为搜寻格瓦拉的支持者，几乎有30万人受到政治迫害。
1967年10月，格瓦拉游击队中的一个逃兵向玻利维亚特种部队透露了他们的营地。几天后，格瓦拉正在附近巡逻时，特种部队包围了营地并捉住了他，他在腿受伤后被迫投降。他身上的衣服几乎全部被丛林撕破，一丝一缕的，有如乞丐。
关于格瓦拉被擒和枪决时的情景，有好几个版本。
有的说，冲突期间，有几个士兵想接近他，他喊道：“不要射击！我是切·格瓦拉，我活著对您来说比死更有价值。”
而另一说法是，他被捕获时身份仍然不为人所知。当时他佩带着一只刚收到的礼物劳力士手表。总统知道他被擒后，便马上命令处死他。
格瓦拉被囚在一个破落的校舍一夜后，第二天下午便在手被绑在板上的情况下，被一个抽签抽到了短秸秆的玻利维亚陆军中士枪毙了。
格瓦拉临死前曾向那名中士说：“我知道你要在这里杀我。开枪吧！懦夫，你要杀死的，是一个男子汉！”而另一个版本是，刽子手行刑前颤抖着不敢开枪，格瓦拉平静地对他说：“开枪吧，胆小鬼，你只是要杀死一个人而已。”他还对他的敌人们说：“革命是不朽的。”
一些人认为，那个中士是向格瓦拉的面部和喉头开枪。但广泛受认同的是，他开枪射击格瓦拉的双腿，以令他的面孔完整便于证明身份；并假装是作战的创伤以隐瞒他是被枪毙的。他们咬住格瓦拉的胳膊以免其大声呼喊，最终见他太痛苦而向其胸口开了枪。
格瓦拉的尸体被直升机送到一个地方医院并展示给传媒。那时被拍摄照片成为一个传奇，很多人颂扬他为圣人。当一名军医切断了他的双手后，玻利维亚陆军将校将其尸首转运去了一个秘密地方，并拒绝透露他的遗骸是否已被埋没或火化。
另外据说，有人当时曾剪下格瓦拉的一些头发，并准备以700万美元高价进行拍卖。
玻利维亚当局10月11日正式向全球报告格瓦拉已于9日被杀。15日卡斯特罗宣告古巴全国哀悼3天。格瓦拉之死被认为大力鼓吹了当时社会主义革命运动思想已遍及拉美和其他第三世界国家。
时隔40年后，2007年，美国中情局前特工、从古巴流亡迈阿密的菲利克斯，首次披露了格瓦拉被处死前的情况（近似上文描述），并称美国政府当时曾极力反对对格瓦拉执行死刑，希望将他运到巴拿马做进一步审讯，但这一要求却遭到了玻利维亚最高军事当局否决。当他对格瓦拉说对不起时，后者立即说：“这样更好，我根本就不应该活着被俘虏的。”
格瓦拉牺牲时，他带领的游击队几乎全军覆没，只有极个别人幸存。而他的尸体究竟埋在哪里，事隔多年已没人能说得清。20世纪90年代，包括玻利维亚在内的南美国家已相继完成政治民主进程，使寻找格瓦拉和他战友的遗骨出现转机。
据玻军方提供的线索，格瓦拉和另6名游击队员遇难后不久就被埋在距格兰德峡谷5公里的一个叫卡尼亚达的地方，此地现为一个废弃的机场。当时参加掩埋的几个证人回忆，因为是在夜间进行，周围黑乎乎的，根本就记不住地点，只记得他们被埋在同一墓穴里。
在玻政府支持下，1995年11月底，玻利维亚、阿根廷和古巴联合组成专家小组，着手调查和寻找掩埋格瓦拉的地方。他们查阅了大量历史资料，采取世界上最先进的高科技手段，使发掘范围缩到最小。古巴先后派出10余名顶级专家协助发掘工作。
1997年6、7月，他们终于找到了这7具遗骨，立即送往圣克鲁斯一家日本人开的医院，3名阿根廷人类学家、3名古巴法医和1名古巴考古学家对其逐一进行全面甄别和DNA鉴定。7月3日《格拉玛报》昭告天下：根据对有关史料的研究，其中一具确实是格瓦拉的骸骨；其他6具分别是4名古巴人、1名玻利维亚人和1名秘鲁华裔。
7月12日，古巴政府派专机接回了格瓦拉及另外4名古籍游击队员的遗骨，暂时停放在哈瓦那市何塞·马蒂纪念馆内。古政府决定以最高规格——国葬安葬格瓦拉及其战友，以告慰亡灵。10月9日（即格瓦拉遇难30周年），古巴国务委员会发出通知，确定当月11日至17日为国丧日，并确定将格瓦拉的遗骨隆重安葬在他生前战斗过的圣克拉拉市。
当天，哈瓦那通往圣克拉拉的公路实行管制，任何闲杂车辆不得通行。圣市数十万群众涌向灵车经过的路旁，到处撒满鲜花，场面十分感人。卡斯特罗在葬礼上发表讲话，颂扬格瓦拉对古巴革命的杰出贡献，称赞他是人民理想的典范、人类良心的典范，是革命者和共产党人的楷模。葬礼结束时，卡亲自点燃了格瓦拉灵前的长明灯。
丰富的情感世界
2007年，在玻利维亚，成千上万的人参加纪念格瓦拉牺牲40周年活动。他的遗孀艾莉妲·马奇带着4个子女出席了追思仪式。格瓦拉与第一任妻子伊尔达·加德亚育有一个女儿，但母女两人均已去世。
2008年8月，美国著名的麦克米兰出版社出版了《我和切在一起的日子：一个革命者的品质》一书，作者正是格瓦拉的第一任妻子加德亚。
该书是1972年加德亚出版的《切·格瓦拉传记》的修订和更新版，讲述了这对曾经的伉俪在一起的日子。1953年12月加德亚遇见格瓦拉，当时她是住在危地马拉的秘鲁政治流亡者，而他则正准备结束穿越拉美的摩托车之旅。该书就是从格瓦拉最著名的著作《摩托日记》结束的地方开始讲述。
在危地马拉，他们通过对哲学、政治和诗歌书籍的讨论逐渐建立起友谊和爱情。“在危地马拉遭遇的一系列人物和事件，使格瓦拉从一个漫游的浪漫主义者转变成一个坚定的革命者。”加德亚写道。
加德亚还为格瓦拉引荐了其他流亡者，包括4位古巴人，这些人（包括卡斯特罗）一起参加了1953年的武装袭击，发起了古巴革命运动，并最终获得了胜利。“从理论上来说，他已经有了共产主义信仰，但是直到他到了危地马拉才真正有了这样的意识。就在那里，他认识了其他的流放者，并开始了解那些为抗争而不惜被捕甚至牺牲的人们。”
1955年9月两人在墨西哥举行婚礼时，卡斯特罗也在场。这年，夫妇俩同卡氏和他哥哥菲德尔在墨西哥城相遇，当时卡氏兄弟正为重返古巴进行武装斗争推翻独裁政权作准备。格瓦拉随即加入了卡氏的军事组织，战士们于1956年向古巴前进，发起革命。格瓦拉迅速成为一名指挥官，并在其后成立的革命政府中担任高层领导。
加德亚和孩子伊尔达则留了下来。1959年1月革命军成功占领哈瓦那。一听到这个消息，母女俩立刻赶往古巴，可迎接她们的却是格瓦拉想离婚这一消息。1959年6月格瓦拉与艾莉妲·马奇结婚。
离婚后的加德亚，对作为革命领导者的格瓦拉仍一直非常忠诚。在他1967年10月被杀害之后，她仍把他奉为英雄。“切·格瓦拉，虽然你人已不在了，但是你的形象，你的事业以及你为之奋斗的原则永存。”这是她在这位曾俘获自己芳心的英雄去世几天后写下的话。1974年加德亚在哈瓦那去世。
在格瓦拉一生最不安定的时候，是加德亚陪伴在他身边，并见证了他从一个空谈理论家成长为坚定革命者的过程。这位极具影响力的领导者的个性和品质，在该书中展现得淋漓尽致。
另据《格瓦拉画传》一书：
1959年1月加德亚带着女儿来到哈瓦那。夫妻相见，格瓦拉却坦言爱上了别人。前者悲痛欲绝。在卡斯特罗建议下，格瓦拉与艾莉妲结婚。人们在结婚时的一张照片上看到，格瓦拉与艾莉妲就像一对两小无猜的玩伴在做游戏。
格瓦拉与艾莉妲结婚时，卡斯特罗是他们的证婚人。由于工作太忙，卡氏在他们的结婚证书上签字之后，在新婚夫妇切开蛋糕之前就离开了现场。艾莉妲皮肤洁白，脸上闪动着幸福之光。能嫁给一位身穿革命军装的男人是莫大的荣耀，当时橄榄绿军装已成为古巴军队的特别标志。婚礼过后，格瓦拉嘴里朝天刁着一支粗棒雪茄烟，自己开门上车，带着新娘回家。幸福的艾莉妲露出了她的白牙齿。
一位英国女历史家认为格瓦拉是一个感情冷淡的人，他不爱自己的孩子，也不爱他爱过的人，他只爱自己的革命，因为他离家出走了。40年后，当伊尔达不断被问及这个话题时，她都会觉得问话者的可笑。格瓦拉其实天生就是个慈祥的父亲。
格瓦拉虽然和子女们在一起的时候极少，却是一个与天下所有父亲具有同样本性的人。他称自己的大女儿伊尔达为一朵“最美的爱情之花”；尽管他与这朵爱情之花的母亲只相处了数年。伊尔达离开母亲，生活在格瓦拉和艾莉妲缔造的新家，其中的心酸他自然了然在胸。因而，相比较其他备受关爱的孩子，伊尔达是格瓦拉最疼爱的一个。他在离开古巴时专门给她写了一封信：“我今天给你写这封信，你却要在很久之后才能收到。但我希望你知道我在惦记着你。我想，你是可以永远为你父亲感到骄傲的，就如我为你感到骄傲一样。”
格瓦拉是读书的天才。即使在行军当中，他也会让自己沉浸在高贵的书籍里。一个拼死前行的游击队员，身上除了一支步枪外，就是一本埃米尔·路德维格的《歌德传记》。这本书他读了很久，每读一段，他都把自己的想象与心得付诸于那本著名的日记中。这使得他有时候并不像一个战士，反而像他那还没有结束的摩托车之旅，又或者如同一个真正的诗人。