后来，达尔文还参加了两个养鸽学会，结识了一些养鸽专家。通过实践，他观察到鸽子身上特别鲜明地表现出亚种和变种的多样性，使他更加相信选配供杂交用的种畜的意义。更加专注地对鸽子进行详细的研究工作。此时，他阅读了许多有关鸽子方面的大量旧著作，并同著名的家禽专家捷格特迈耶尔就很多细小问题和琐事进行了频繁的书信来往，进一步探讨家禽变异的问题。
达尔文不光对鸽子一类家禽感兴趣，而且还亲自开辟了一块6平方米的小小“种子植物园”，对植物进行仔细观察。他在这里注视每一棵从种子中生出来的幼芽的命运。大量的幼苗对他产生了强烈的印象，而更强烈的印象是大量死亡的幼苗。经过仔细观察，这些幼苗都是被蜗牛弄死的。在慕尔公园，达尔文认真观察了长有青松的山丘那些被围起来的和未被围起来的地段之间的差别。在被围起来的放牧地段上的一群松树周围，长出了很多小树，就好像是有意被人栽在那儿的。而在未被围起来的地段上，什么都没有，找不到一棵小树。但是，当他走到跟前时，在那里找到了几千棵全都比帚石南要矮的松树，因为牲畜经常把这些树尖啃光。研究它们以后，他深信，这些3英寸高的小松，据年轮判断却在25年以上，这一观察结果，被达尔文作为生存斗争复杂性最好的例证写进了《物种起源》的书中。
虽然已经拥有大量的事实，但达尔文仍然不停地搜集和实验，他向凡是与自己有通讯联系的人提出各种各样的问题。在思索细小生物身上表现的返祖特征时，他请朋友帮助提供各种品种的马、驴等背上的黑条纹和肩上的横向条纹的事实，为了要解决大海是不是使动物植物分迁的真正不可克服的障碍问题，达尔文决定研究植物的种子和动物的卵在海水里是否会飘流，它们在盐水里究竟能活多长时间，以便证明在被大海隔开的一些地方有某些相同植物存在的根本原因。他把莴苣、萝卜、白菜、山莴苣、胡罗卜、芹菜和洋葱的种子统统装在放盐水的瓶子里。过了一段时间，尽管水发臭了，可是所有这些种子，除了部分白菜籽外，都长得非常好。虽然许多种子很好地经受了盐水的浸泡，但是很快就被浸透而下沉。这种情况使达尔文大失所望，他觉得以前自己所下的功夫都是徒劳的，纯粹是自找麻烦。
失败并没有使达尔文丧失信心，他仍然不厌其烦地继续工作，继续各种新的实验。为了弄清植物方面的问题，他不光同虎克商议、探讨，而且还向其他植物学家请教。这期间，他联系最多的就是美国植物学家爱沙·葛雷。
爱沙·葛雷出生于纽约洲，比达尔文小两岁。他大学读书时成绩非常出色，尤其热衷于植物学。1834年，他出版了《北美的禾本科和沙草科》一书，由于这本书，他开始同一些欧洲学者通信，此后又以教授的身份到了欧洲，观看了欧洲的植物园和各种收集品，并同著名的植物学家建立了私人关系。在伦敦，他结识了罗伯特·布朗、奥温、植物学家林德雷和其他许多博物学家。爱沙·葛雷刚刚返回美国，就被聘为旧哈佛大学的植物学教授。因为他努力钻研植物学的课程，内容讲的新颖、丰富，很快成了美国植物学家的首领。
达尔文十分钦佩爱沙·葛雷这位精力充沛的植物学家，并且主动与他进行通信交往。达尔文在第一封信里告诉爱沙·葛雷，自己从事研究生物的变迁已经好几年了，已经对动物得出了一些结论，恳切地征求爱沙·葛雷对他的结论意见，同时表明自己对美国高山植物非常感兴趣，希望他能提供一些资料。爱沙·葛雷收到达尔文的信后，非常乐意地答复了他所提出的要求，除了写信和邮寄美国高山植物统计表外，还把自己的新版植物学课本寄给了达尔文。达尔文当时正致力于地理分布和类型的种属关系问题的研究，因此建议爱沙·葛雷在课本再版时，能在美国植物统计表里，指出哪些植物是当地的，哪些植物是从欧洲移植过来的，还要指出这些植物的产地在哪里，他感兴趣的还有各种植物区系“相近的”物种，他请葛雷为他指出这样的物种，哪怕是在旧的校样里指出也行。
爱沙·葛雷由于受到达尔文询问的影响，撰写和刊出一篇《北美合众国的植物区系的统计》。达尔文在收到这篇论文后，对爱沙·葛雷所做的关于大属的物种总是有着广泛的分布范围的结论非常高兴。因为这个结论同达尔文从分析其他植物区系所得的结论以及他的理论观点是一致的。与葛雷在学术上的频繁交流，更加激发了达尔文研究植物的热情，然而，坚持不懈的工作，使他的健康状况恶化了，他不得不放下手里的工作，到慕尔公园的温泉疗养院进行水疗。医生告诉他必须多散步，多吃饭，少思考。他自己也下决心绝不思考“鸟兽是怎样形成的”这些问题，而实际上他根本无法忘记自己所关心的理论问题。这期间，他除了尽量充分休息外，还常常写信，与各方面的专家、学者围绕物种起源问题进行不间断的探索，为尽可能完整地阐述进化论观点，做着积极的准备。
1858年，他开始写作《物种起源》，只用了一年多的时间，就完成了这部震惊世界的名著。
1859年11月24日，伦敦几家书店门庭若市，人们在争相购买新出版的《物种起源》，1250册一天之内销售一空。整个英国受到了达尔文进化论的冲击，刮起了“达尔文旋风”。
《物种起源》一书详细地介绍了达尔文的进化理论。他推翻了上帝创造万物的宗教学说，认为生物都是从低等到高等逐渐进化而来的。在自然界中，可利用的生存空间是有限的，各种生物为了食物，进行着你死我活的竞争，也就是永恒的生存斗争。最能适应环境的就能够生存下去，而其他的就要死亡。这被称为“适者生存”。但是，随着时间的推移，环境也随着变化，因而生物也随着变化。就是说，从一个种类演化到另一个种类，以便在新环境中生存下去，这被称作“自然选择”。
《物种起源》的出版是自然科学史上的一个最重大的事件，它成了19世纪绝大多数有学问的人改造世界的开端。世界上的万物不是上帝创造的，而是地球上的原始生物不断繁衍进化而来的，达尔文为此收集了不少事实。《物种起源》为科学界提供了驳不倒的证据，它还用变种和选择的观点来解释化石、地质分布、发育不全的器官、胚胎学上的类似和分类等。
进化的学说不是达尔文首创的。但是，达尔文却提供了有力证据，丰富了进化学说的内容，从而在科学的基础上建立了自然选择的物种起源说。
达尔文理论对于生物科学，就像哥白尼革命对于宇宙科学一样，它将人们引向了一个正确的研究生物科学的途径，刺激和鼓励着人们在此基础上再去实验和观察。它的影响是全社会都感觉的到的。《物种起源》是不朽的，达尔文的名字也将永垂史册。
《物种起源》的出版，立即在社会上引起了轰动。不过这种轰动主要是反对，而不是赞同。教会的大小牧师一片咆哮，科学界的保守势力一片叫喊。
极力维护神学的教士们，斥责达尔文的进化论是异端邪说，叫嚷着要“打倒达尔文”，“扑灭邪说，拯救灵魂”。
在科学界，那些保守的科学家也加入到攻击达尔文的行列。号称生物学界权威的欧文，原来是达尔文的好友，也成为反对进化论的代表人物。甚至连达尔文的地质学老师都说他的学说是荒唐的。
真理是不可战胜的，达尔文学说终于被越来越多的人接受。
《物种起源》一书建立了自然选择的物种起源说。这本书的出版，使达尔文的名字不但可以同牛顿的名字并列，而且他的工作将永远被看成是19世纪自然科学的最大成就之一。
《物种起源》一书出版的这一天，不只是在达尔文的个人生活中具有重大意义，这也是19世纪50~70年代大批有学问的人对生物界的观点和对人在生物界中的地位的观点开始转变的一天，这种转变就像哥白尼在16世纪因指出地球在宇宙中的位置而实现的转变一样。然而，在此之前，为捍卫达尔文主义这一进化论学说，曾不得不进行了10年的尖锐斗争。在10年的斗争过程中，达尔文的思想以及达尔文本人，曾经不断地受到攻击，这些攻击常常是粗暴的，恶毒的和不公正的。达尔文的为人一向很温和，甚至对自己的对手也十分彬彬有礼，他并没有和反对者进行针锋相对辩论，而是以他那部不断地发行新的版本和译本的出色著作《物种起源》，不知不觉，不声不吭地击败了各个对手，说服了那些动摇分子，在越来越多无私地寻找真理的人们中间，为自己争得了许多朋友和信仰者。
“风格则是人的本身”，这是一位早期进化论者，达尔文的一位前辈的名言。那么，《物种起源》一书是以怎样的风格体现达尔文本身的风格呢？赖尔教授的评价是：“整个书就是一个长的论据，它被用来论证整个进化论理论，特别是用来论证对这种进化原因给予最完美的说明的自然选择理论。”达尔文所阐述的观点是以事实为依据的，他认为，人们通过对种公畜的人工选择，或者通过对留作种子用的最接近理想的植物的育种选择，能够培育出许许多多家畜的品种或数千种栽培植物的亚种来。他证明，由于变异和遗传，人们能够获得这些结果。由于变异，也就是说，由于一对动物的后代，或者由同一个菜的种子生长出来的植物，彼此之间略有区别这种情况，选择是可能的；而由于遗传，即经常看到的亲本将特性传给后代这一情况，通过选择优良的植物种子，就能够获得具有这些改良特性的后代。