11月18日，宋美龄随同蒋介石和王宠惠(国防最高委员会秘书长)、商震(军事委员会办公厅主任)、林蔚(侍从室第一处主任)、周至柔(航空委员会主任)、董显光(宣传部副部长)、俞济时(侍卫长)等16人，自重庆乘飞机启程，飞往开罗，途经安哥拉、卡拉奇各留宿一夜后，于21日在开罗郊外的培因机场着陆，旋即乘车穿越开罗市区，抵达设在金字塔旁边的会场——米内饭店。在该饭店附近新设有高射炮阵地及雷达基地，并驻有英军一旅，戒备森严。史迪威和陈纳德都参加了这次会议，蒋介石是希望史迪威在开罗会议上“力陈中国在战胜日本过程中的军事作用，说服大会接受中国所提出的要求”。为此，蒋介石一面接受了史迪威替中国起草的计划，准备在开罗会议上拿出来。这份计划分两个部分，先是介绍蒋介石的一些打算，然后是向盟国提出的一些要求，“史迪威的抱负在这份计划中得到了充分体现”。另一方面派宋美龄拉上宋霭龄去做史迪威的工作，希望他在即将举行的开罗同盟国会议上能为中国多多美言，请他出面“帮助协调好中国和其他大国的关系”，宋美龄姐妹俩还向史迪威保证，她们将努力使他在中国的所有建议都能实现。
11月23日，开罗会议开幕。罗斯福满怀热情，丘吉尔半心半意，蒋介石则是抱着讨价还价的目的要求罗斯福增加军用物资和贷款(会后提出了10亿美元的要求)，整个会议是关于远东战略问题的辩论。这是一次规模最大的聚会，所有知名的英美军官都参加了。据史迪威记载，因为会议人数太多，以至于“浴室都紧张起来了”。会上，在这些都穿着军装的出席者中，宋美龄是唯一不穿军装的女性。
史迪威描绘说：“宋美龄穿着一件绣着金色菊花的紧身黑缎旗袍。她的头发上和露出脚趾的高跟鞋上，用黑色丝带打着蝴蝶结，她尽力以她那优雅举止和旗袍开衩处一闪一闪地露出的匀称的腿来吸引与会者的注意力。”会议一开场，首先由罗斯福致词。继之，由蒙巴顿(东南亚盟军最高统帅)报告英国方面在拟议中的反攻缅甸计划。英国的计划是：“在1944年元月中旬，中国军向缅甸北部、英军向缅甸西部同时进攻，预期在四月间收复北缅。”但中国方面，早就主张应夺回包括仰光在内的缅甸全境，以恢复滇缅路，确保对中国的补给路线。因此，蒋介石向丘吉尔提出：在陆军反攻缅甸的同时，英国宜采用向孟加拉湾出动海军，夺得制海权，切断日军补给线，自南北两面夹攻缅甸的陆海协同作战。丘吉尔当即以积极态度答称：“英国海军集中时期，当在春夏之间。”接着又说：“海军集中，事关机密，不便在此宣示，其详细内容，容俟面告。”会后，蒋介石三度与丘吉尔晤谈，以谋早日见诸实现。
当晚，宋美龄随蒋介石同罗斯福会谈，罗的顾问霍普金斯在场。会谈的主要议题有三个：一是关于日本的天皇制应予保持还是废除，蒋介石认为：“不能再让其起来预闻日本政治以外，至于他国体如何，最好待日本新进的觉悟分子自己来解决。”关于日本的占领问题，蒋介石认为：“此应由美国主持，如需要中国派兵协助亦可。”二是关于东北与台澎应归还中国，蒋介石认为：“东北四省与台湾、澎湖群岛，应该归还中国；惟琉球可由国际机构委托中、美共管。”关于朝鲜问题，蒋介石认为：“使朝鲜人民达成独立之目的。”三是关于国、共问题及香港问题，罗斯福建议组织“国共统一政府”；香港之归还中国，也以“组织国、共统一政府为条件，允为努力促其实现”。
蒋介石同罗斯福的这次会谈未作正式记录。根据1957年台湾向美国国务院外交文件编纂处提供中方记录英译文：“关于中国的国际地位：罗斯福表示，中国应取得四强之一的地位，并平等地参加四强机构，参与制定该机构的一切决定，蒋介石答称，中国将欣然参加四强的一切机构和参与制订决定。关于中国的领土：蒋罗双方同意，日本用武力从中国夺去的中国东北四省、台湾和澎湖列岛，战后必须归还中国。经谅解，辽东半岛及其两个港口，即旅顺和大连必须包括在内。
罗斯福一再问，中国是否想要琉球群岛。蒋介石答称：中国愿由中美两国共同占领该群岛，最后，在一个国际组织的托管下由两国共管，罗斯福还提出香港问题，蒋介石建议，在进一步考虑之前，请罗斯福跟英国当局讨论一下这个问题。”
在开罗会议上，宋美龄嫌官方译员未能把蒋介石的看法准确地表达出来，于是她亲自把蒋介石所说或马歇尔对蒋介石所说的每一句话都重新翻译一番。
26日，《开罗宣言》定稿，蒋介石在这一天的日记中写道：“与罗斯福会谈至四时半，邱吉尔、艾登(英国外相)、贾德干(外次)、哈里曼(美驻苏大使)及王秘书长宠惠(国防最高委员会秘书长)皆到会。”“彼等已将公报(宣言)草案商讨修正，乃即由艾登在会中朗诵一遍，余与罗、邱二氏皆同意，遂作为定稿，惟须待罗、邱与斯大林于德黑兰会谈完毕后，再约期公布；余允之。”12月3日，《开罗宣言》正式发表，蒋介石在4日的日记上说：“昨日发表开罗会议公报以后，中外舆情无不称颂为中国外交史上空前之胜利。寸衷惟有忧惧而已。”
从总体来看，此次开罗会谈，是有利于中国和亚洲殖民地人民的，在此基础上发表的《开罗宣言》也是有积极意义的。
关于会议的经过，蒋介石的日记上记下了有关宋美龄的活动：十一月二十一日(星期日)上午七时零五分开罗时间，乘飞机自喀拉岂抵开罗市外之培因机场(Pa-YneField)，来迓者陈纳德将军及美国第九航空队军官等，美空军站长备汽车，由陈纳德将军前导，经开罗市区至尼罗河西岸十五公里之米纳饭店议场，由该议场英军人员迎接，引导至第一号别墅官邸驻节。
十时，英国中东事务大臣加塞(Casey，RichardG.)来访，表示未曾预知到达时间之歉意，又因蒋夫人目疾未愈，欲代约医生来诊，由王秘书长宠惠婉谢之。
……十一月二十二日(星期一)……下午一时，霍普金斯来访，谓罗斯福总统早间已抵开罗，约主席及夫人，下午在罗斯福别墅相见。十一月二十三日(星期二)……九时，赫尔利大使来，谈中英美在缅军事合作事，夫人同见，蒋主席以斯大林是否到此与罗邱相见为问，赫尔利以斯大林不来开罗对。十一时，偕夫人率商震、林蔚、朱世明出席罗斯福官邸第一次高峰会议。(下午)七时半，偕夫人同王宠惠赴罗斯福总统晚宴，十时半归，并约明日续谈，霍普金斯在座。十一月二十四日(星期三)……下午四时半，霍普金斯来，谒蒋夫人后与王宠惠会商开罗宣言内容，王秘书长译后呈阅，经奉指示，修改后始核定。十一月二十五日(星期四)……上午九时半……邱吉尔首相偕蒙巴顿将军及艾登外相来访续商反攻缅甸问题，委员长劝邱吉尔提早海军登陆之时间，未获具体结果。上午十一时四十五分索谟威尔来，迎往罗斯福官邸，参加三国领袖摄影，蒋夫人、王宠惠、林蔚同往摄影时，罗氏让蒋主席坐中位者至再，蒋主席坚辞，乃自坐其右侧，邱吉尔坐左侧，最后，邀蒋夫人同坐(英国幕僚霍立斯将军叹曰：惜无人让我首相中坐。见James Leasor的The Clock With Four Hands，P.263)。摄影后王宠惠再访霍普金斯，讨论开罗宣言稿。
……下午四时，偕夫人赴罗斯福官邸会议。罗斯福次公子在座。十一月二十六日(星期五)……上午十一时十分，蒋夫人赴罗斯福官邸商谈。午十二时，约金上将午餐，夫人在座，商震、林蔚、周至柔、杨宣诚、朱世明均作陪金上将对于派遣学生赴美研习海军，表示欢迎，并愿负责教育。下午三时，偕夫人赴罗斯福官邸会议。十一月二十七日(星期六)……晚十一时，偕夫人乘机起飞，三小时后(二十八日晨二时)第二批随从人员起飞。罗斯福的日记上也简单地记下了宋美龄的活动：
十一月二十二日(星期一)上午九时三十五分，自突尼斯飞抵开罗英空军机场，比预定时间迟一小时半。下午，邱吉尔首相，蒋主席及夫人相继来访。十一月二十三日(星期二)十一时，苏俄外次长维辛斯基来谒，邱吉尔偕女公主来，蒋介石夫妇及随员商震、林蔚、朱世明同来。(下午)八时至十一时，宴蒋介石夫妇。十一月二十五日(星期四)……(下午)四时，蒋主席夫妇来会谈并茶叙。十一月二十六日(星期五)上午，蒋夫人来，蒙巴顿来。(下午)四时半，邱吉尔、蒋主席、蒋夫人、哈里曼、艾登、贾德干等来，开罗宣言定稿。
应该说，宋美龄是开罗会议上中国方面仅次于蒋介石的主要参加者，她的作用从某些方面讲超过了蒋介石。
评论说：“1943年开罗首脑会议是宋美龄政治生涯的顶点，也是蒋介石走向末路的开端。”在开罗会议期间的一张首脑们的合影照片，的确留下了一段历史的纪念。“尼罗河畔，礼宾官员安排四位著名领袖坐在一排拍照，意在提高蒋在历史上的历史地位。同样的画面有许多不同的镜头，委员长在照片的左方，依次，第二个是罗斯福总统，第三个是邱吉尔首相，右边是蒋夫人。邱吉尔穿着白色三件头服装，脚着黑袜，口中叼着雪茄，丰满的腿上放着一顶灰色汉堡帽。在他身旁，美龄穿着普通的旗袍，外罩白色短大衣，脚上的鞋子扣着网眼蝴蝶结。最左端的委员长穿一身利落的军服，高高的衣领佩着三星领章；戴手套的双手拿着一顶上面缀有国民党青天白日帽徽的军帽。在他的身旁，罗斯福穿着双排纽的华达呢服，看上去身体虚胖精神困倦，他的跛腿为拍照摆出不受拘束的角度。”在开罗会议上，宋美龄是三巨头之外的另一位巨星。有评论说：“蒋介石出身中国传统社会，对于西方事务并不熟悉，他的个性刚硬，面对西方强权往往采取倔强不屈服的姿态，宋美龄是蒋介石外交事务的最高参谋，也是他与国际人士互动的时候最佳的润滑剂。”在开罗，宋美龄代表蒋介石与各国人士商谈周旋，甚至一天要工作十个钟头，蒋介石在日记中表示“这种工作非常人能胜任也”。在台湾公共电视制作的《世纪宋美龄》的片子中，北乔治亚州立大学历史系主任杰斯伯森对宋美龄有这样一段评说：“蒋夫人在开罗会议中的角色非常有意思。英、美、中领导人的配偶，只有她出席这样的会议，并且公开扮演举足轻重的角色。只要拿开罗会议的照片，就可以看到蒋夫人坐在椅子上，坐在罗斯福总统旁边，坐在邱吉尔首相旁边，三个人谈笑风生。当然是因为她会说英文，罗、邱也都讲英文，比起丈夫她更能和他们沟通无碍。除了在公开场合露面，她还出席会议，担任翻译，和英美的海陆军将领讨论协防中国的事宜。”
罗斯福曾经对美国知名记者斯诺说：“我对蒋介石在开罗的表现，始终没有什么印象，事后回想起来，我才发现我对蒋介石的了解，以及蒋介石的想法，都是蒋夫人转述的，她总是如影随形，随时转述他的答复。我认识的其实是蒋夫人，而不是蒋介石。”
在开罗会议之后，在史迪威和陈纳德先后离华之前，宋美龄于1944年7月1日离开中国去巴西看望宋霭龄。9月间又转达美国，一直住到1945年9月中国的抗日战争取得了胜利后才回国。