1939年冬至1940年春，国民党顽固派不顾民族存亡之危，掀起第一次反共高潮。1939年1月国民党五届五中全会虽然没有放弃抗日的旗帜，但却制定了“限共”、“防共”、“反共”的方针。同年11月，国民党五届六中全会进一步确定以“军事限共为主、政治限共为辅”的方针。
中国共产党坚持“人不犯我，我不犯人，人若犯我，我必犯人”的自卫立场，在军事上、政治上“有理、有利、有节”地迎击和打退了国民党的第一次反共高潮，并维护了抗日统一战线。同时，中共中央领导各地党组织继续着手发动群众，进一步独立自主地扩大军队，从而使自己的力量得到进一步的发展壮大。
1940年秋，蒋介石集团又掀起了第二次反共高潮。这次反共活动将重点由华北转向华中。在当时，新四军副军长项英和政治部主任袁国平思想右倾，对国民党只讲联合不讲斗争，也助长了国民党的反共气焰。
1940年9月中旬，国民党江苏省主席兼鲁苏战区副司令韩德勤故意制造磨擦，调动主力向位于江苏北部的南端的新四军重要基地黄桥进逼，企图将在苏北的新四军歼灭于黄桥附近。新四军苏北指挥部出于自卫，在10月4日至6日进行反击韩德勤部队的进攻，消灭该部11000人。
10月19日，蒋介石指使国民党参谋总长何应钦、副总长白崇禧，用国民政府军事委员会的名义，打电报给八路军总司令朱德、副总司令彭德怀和新四军军长叶挺、副军长项英，诬称八路军、新四军“不守战区范围，自由行动”、“不打敌人专事并吞友军”，并限令八路军、新四军于电到1月内，全部开到黄河以北的冀察地区。
10月25日，毛泽东致电周恩来提出：“我们应估计到最困难最危险最黑暗的可能性，并把这种情况当作一切布置的出发点。”11月9日，朱、彭、叶、项发出答复何、白的电报。电文据实驳斥了何、白电报的各种诬蔑不实之词，同时表示，为顾全大局，相忍为国，决定新四军皖南部队将开赴长江以北，但须宽限时日。电报发出后，中共中央连电叶、项，要求皖南部队务必于12月底以前全部北移，并认清形势的严重性，提高警惕，做好北移的准备工作。
12月9日，蒋介石发布命令，限长江以南的新四军于12月30日前全部开到长江以北地区，限黄河以南的八路军所有部队于12月31日前开到黄河以北地区。第二天，蒋又密令第三战区司令长官顾祝同，如新四军至12月31日仍不北渡，应立即将其解决。12月下旬，顾祝同根据蒋的密令，调集7个师共8万多人的兵力，在皖南泾县、太平、宁国、旌德一带部署成口袋形阵地。12月31日前，完成了全歼转移中的新四军部队的一切准备。
1941年1月4日，新四军军部及其所属皖南部队9000余人分三个纵队，奉命北移。他们是按照国民党指定的路线转移的。
1月6日黄昏，当新四军走到泾县茂林地区丕岭脚下时，前卫部队突然遭到国民党两个师的阻击。军长叶挺果断地指挥3个纵队进行反击。激战到第二天拂晓，3个纵队分别占领了求岭、高岭、丕岭3个重要的制高点。叶挺认为，从眼前的情况来看，不论是从正面猛打猛冲，还是从两侧乘虚穿插，都有把握打出去，因此主张组织突围，先拿下星潭，然后往旌德、宁国方向进军，再转向苏南，和新四军江南部队汇合。可是项英认为叶挺的方案太冒险，动摇不定。讨论了7个小时，最后项英实行个人专断，否定了进攻星潭的主张，命令部队改向西南方向行动，企图通过太平进入黄山。然而，就在这几个小时里，国民党军的7个师逐渐完成了对新四军的四面包围这样，新四军丧失了突围的良机，陷入重围。
在沿途的山岭上，新四军各部队跟比自己多好几倍的敌人展开了激战。叶挺在前沿指挥作战。项英却带着几位军部指挥员及少数警卫员，离队去寻找小路突围。这样，顿时动摇了部队党的领导核心。叶挺几次派人去寻找他们，都没有找到。9日拂晓，叶挺只得向中央报告请示。
当天下午，中共中央中原局复电指示，一切军事行动由叶挺指挥，部队要想尽一切办法向苏南突围。根据中央指示，叶挺把全体高级干部都集合在军部指挥所——汪家祠堂里。他郑重地传达了中央的指示，最后流着热泪说：“为了党的事业，为了人民的解放事业，我们一定要战斗下去，从我到每个战士都应该下定这个决心，就是战斗到只剩下一个人，也要和卖国贼打到底！”
在叶军长忠于党、忠于革命的英雄气概鼓舞下，新四军英勇拼杀，在双方兵力悬殊的情况下，血战7昼夜。13日黄昏，敌人向新四军发起总攻。形势越来越险恶，为了保存抗日火种，叶挺军长冒着生命危险，亲自到国民党第22集团军总部去谈判，结果被敌司令上官云相这个无耻的家伙扣押了。
到14日，持续了7天7夜的激战逐渐平息下来。新四军皖南部队9000多人，除了陆续突围出去2000多人以外，其余6000多人，一部分壮烈牺牲，一部分受伤后被捕。副军长项英突出重围后，被叛徒杀害。17日，蒋介石令中央通讯社发布国民政府军事委员会的通令和发言人谈话，宣布新四军“抗命叛变”、“着将”该军番号撤销，军长叶挺革职”、“交军法审判，依法惩治”。
这就是国民党顽固派制造的震惊中外的皖南事变。
皖南事变发生后，党内外一些人感到，形势又将是1927年四一二政变的重演，认为国共合作快要破裂，内战可能扩大。然而，这时的共产党已有了能够总结历史经验的成熟的领导。中共中央在认真分析了当时的严重形势后，从实际出发，决定仍然以抗日大局为重，坚持又联合又斗争、以斗争求团结的政策，在军事上严守自卫，在政治上坚决反击。
1月18日，中共中央发言人发表谈话，揭露国民党当局制造皖南事变的罪行和1月17日通令的反动实质。20日，中共中央军委发布重建新四军的命令，任命陈毅为代理军长。同时提出了解决皖南事变的12条办法。
在重庆，周恩来向国民党当局提出严重抗议，并在舆论方面展开了猛烈反击。1月17日，周恩来打电话给何应钦，怒斥说：“你们的行为，使亲者痛、仇者快。你们做了日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人！”
共产党的正义自卫立场和妥善处理皖南事变的合理主张，得到了全国人民、各民主党派、海外侨胞的广泛同情和支持。国际上，苏联对国民党当局制造皖南事变表示严重不满。英、美等国因为要中国继续抗战，也不赞成蒋介石发动反共内战。美国发出正式声明：美国在国共纠纷未解决前，无法大量援华，中美间的经济、财政等各种问题不可能有任何进展。
事情的发展完全出乎国民党顽固派意料之外。在极端孤立的狼狈处境下，他们的反共活动不得不有所收敛。3月8日在第二届国民参政会上，蒋介石表示皖南事变不牵涉党派政治，“保证以后绝无剿共军事”。
蒋介石的反共政策，不但没有达到摧毁共产党的目的，反而教育了许多原来对他抱有幻想的人们，使蒋介石自己处于被动地位；并使更多的人看清中国共产党确实以民族利益为重，而不是只顾一党一派私利的，从而使国民党对中国共产党所作的种种诬蔑宣传不攻自破。中国共产党在全国的政治地位也由此大为提高。