20岁自国立列奥纳多技术学院毕业后，她拒绝了父母亲要她当教师的希望，决心研读她热爱的科目——生物学，并执意进入医学院就读。然而，在当时非常保守的欧洲社会里，“女孩子学医”可谓荒谬与决不可能，这之前也不曾有女子就读医学院的前例，但蒙台梭利不顾父亲的反对以及教育制度的限制，凭着自己不屈不挠的努力，终于在22岁获准进入医学院研读。因为她违背了父亲的意愿，所以父亲中断了对她经济上的资助。她靠奖学金及家教维生，度过那段学医的艰辛路程——奠定了她生物学的深厚学养，以帮助她了解人类成长的法则。
蒙台梭利是班上唯一的女生，时常单独留在解剖室做实验，再加上家人的反对，这沉重的压力，无人可倾诉，但蒙台梭利却能愈挫愈勇，因而培养出异于常人的毅力，为她日后献身孩子教育，奠定了成功的基础。
1896年，蒙台梭利以她的才华和斗志，突破了种种常人难以克服的束缚，以第一名的优异成绩毕业于罗马医学院，成为意大利的第一位女医学博士，名震全国。但由于当时社会对女性的歧视，她仅被聘为精神病诊所的助理医师。不过，这份工作却促使了蒙台梭利对教育萌发热忱，也是她献身孩子教育的起点。